德国科学天博体育平台家发现阿尔兹海默症发病
发布时间:2021-03-19 19:47

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  AD是老年人最常见的神经退行性疾病,其病理特征为神经炎性斑块和神经原纤维缠结。神经原纤维缠结的主要蛋白质复合物是过度磷酸化的tau蛋白,而在神经炎症斑块中Aβ是主要的蛋白质复合物。

  AD中的大部分Aβ是N末端截短或修饰的Aβ变体,这类Aβ更具疏水性和淀粉样变性,但是关于其是如何产生的、以及涉及到哪些细胞类型或蛋白水解酶等问题,目前尚不清楚。反应性星形胶质细胞和小胶质细胞被认为是这些Aβ变体潜在的来源之一,已有的研究报道了星形胶质细胞和小胶质细胞在AD中可分泌比神经元更高比例的末端修饰或截断的Aβ变体。

  另一方面,组织蛋白酶B(CatB)被分析表明发挥β分泌酶活性,可促进Aβ的产生;但它似乎又通过C端截短来降解Aβ,这使得其在Aβ代谢中的作用变得十分不清楚。在AD患者脑组织和血浆样本中均已检测到CatB水平升高。因此,为了研究CatB对Aβ产生的具体作用,来自德国的研究人员在鸡和人的原代星形胶质细胞上研究探讨了CatB的确切生物学作用。

  1. 细胞过氧化半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64d和CA-074Me可降低Aβ2-40的含量

  免疫印迹结果检测细胞培养上清液中的Aβ2-x含量,结果显示,在用E64d和CA-074Me处理鸡星形胶质细胞后,Aβ2-x含量均降低为对照组的50%以下。相反地,E64d并不能降低Aβ1-x的含量;而在高浓度的CA-074Me处理后,结果显示,Aβ1-37、Aβ1-38和Aβ1-39的含量略有降低,但Aβ1-40和Aβ1-42含量无明显变化。天博体育平台

  有趣的是,CA-074Me治疗显著降低了单个特异的Aβ变体(标记为Aβ1-x),而Aβ1-x的确切长度和化学结构仍未确定,进一步研究发现Aβ1-x与其他Aβ1蛋白的等电点位移有很大不同。因此总的来说,两类细胞蛋白酶抑制剂处理降低了原代星形胶质细胞培养上清液中Aβ2-x的相对含量。

  图1:Aβ2-x相对量的变化

  2. 培养的鸡星形胶质细胞中成熟CatB蛋白水平和CatB活性高于神经元

  由于CA-074Me似乎主要影响星形胶质细胞分泌的Aβ2-x,因此研究人员继续比较了培养的星形胶质细胞和神经元中CatB蛋白的相对丰度及其酶活性。Western blot结果显示,星形胶质细胞中成熟CatB的表达和细胞裂解产物中的CatB活性是神经元的4倍以上。另外与神经元相比,星形胶质细胞主要表达更长的APP亚型,因此将继续选择APP751亚型进行细胞系的转染。

  3. 在H4 APP751神经胶质瘤细胞中,CRISPR/Cas9对CTSB的敲除和CA-074Me对CatB的抑制作用增加了Aβ总量的分泌

  研究人员首先建立了H4 APP751细胞系方便后续检测Aβ含量。在使用CA-074Me处理后检测发现,Aβ2-x浓度降低,但细胞总蛋白水平略有升高,同时细胞裂解产物中的CatB水平保持不变。天博体育平台另一方面,当使用CRISPR技术敲除CTSB后发现细胞培养上清液中Aβ2-x的丰度略有降低。总体而言,CA-074Me和CatB基因敲除药物抑制CatB后的观察表明,CatB可能参与了神经胶质瘤细胞中Aβ的降解,但对原代星形胶质细胞没有明显影响。

  图2:在H4 APP751神经胶质瘤细胞中,CRISPR/Cas9对CTSB的敲除和CA-074Me对CatB的抑制作用增加了Aβ总量的分泌

  4. 细胞特异性CatB抑制剂CA-074和ATP酶抑制剂Baf-A1对Aβ1-x分泌的抑制作用

  由于CatB的抑制作用对于原代星形胶质细胞或H4细胞的不同影响可能是由于活性CatB定位不同导致的,所以研究人员用不渗透CA-074处理细胞进行接下来的探究。结果显示,CA-074降低了Aβ2-40的量,其程度与CA-074Me相似。而Baf-A1处理导致Aβ1-x显著降低,而Aβ2-40的量增加。

  图3:细胞特异性CatB抑制剂CA-074和ATP酶抑制剂Baf-A1对Aβ1-x分泌的抑制作用

  5. CA-074Me的治疗改变了人星形胶质细胞和H4细胞的溶酶体形态

  染色后24小时结果表明,CA-074Me处理后检测的颗粒平均荧光强度和尺寸的增加。

  6. 总结

  溶酶体CatB似乎与神经胶质瘤细胞培养基中Aβ1-x的降解有关,天博体育平台但与原代星形胶质细胞无关;然而,星形胶质细胞中N末端截短的Aβ2-x的产生似乎是由血浆膜相关的CatB介导的。

  参考文献:

  Oberstein TJ, Utz J, Spitzer P , Klafki HW, Wiltfang J, Lewczuk P , Kornhuber J and Maler JM (2021) The Role of Cathepsin B in the Degradation of Aβ and in the Production of Aβ Peptides Starting With Ala2 in Cultured Astrocytes. Front. Mol. Neurosci. 13:615740. doi: 10.3389/fnmol.2020.615740